Реагенты для обнаружения CellEvent Caspase-3/7 Green и CellEvent Caspase-3/7 Red являются новыми флуорогенными субстратами для активированной каспазы-3/7 в живых клетках, которые можно фиксировать и мультиплексировать с рабочими процессами обнаружения антител, такими как иммунофлуоресценция (IF) и иммуноцитохимия (ICC). Активация каспазы-3 является важным событием во время апоптоза, что делает эти реагенты оптимизированными для анализа апоптотических клеток. Реагент для обнаружения CellEvent Caspase-3/7 Red также можно использовать для обнаружения апоптоза в клетках, экспрессирующих GFP.
Характеристики этих индикаторов включают:
• Оптимизированный субстрат каспазы-3/7 для анализа апоптоза
• Простота использования — добавьте и считывайте; лизис клеток не требуется
• Используйте для измерений динамики времени; легко выберите интересующую временную точку
• Совместимы как с флуоресцентной визуализацией живых клеток, так и с методами фиксации на основе формальдегида
• Поддержка мультиплекса — объединяйте с другими флуоресцентными реагентами для подтверждения апоптоза в той же клетке или популяции клеток

Реагент для обнаружения каспазы-3/7 Green CellEvent™ : Максимумы поглощения/эмиссии ∼502/530 нм. Обнаруживается с помощью традиционного набора фильтров FITC/GFP.

Реагент для обнаружения каспазы-3/7 Red CellEvent™ : Максимумы поглощения/эмиссии ∼590/610 нм. Обнаруживается с помощью традиционного набора фильтров Texas Red.

Реагент для обнаружения каспазы-3/7 Red CellEvent™ и каспазы-3/7 Green CellEvent™ поставляются в виде сухого порошка. Просто добавьте 100 мкл PBS к сухому порошку, чтобы получить 100-кратный исходный раствор. Разбавьте этот 100-кратный исходный раствор 1:100 в полной среде и окрашивайте клетки в течение 30–60 минут, а затем проанализируйте с помощью флуоресцентного микроскопа.

Реагент для обнаружения каспазы-3/7 Red CellEvent™ также поставляются в виде уже приготовленного раствора ДМСО. Раствор ДМСО представляет собой 400-кратный исходный раствор, который готов к использованию. Просто разбавьте в питательной среде 1:400 и окрашивайте клетки в течение 30–60 минут.

Чтобы предотвратить вымывание апоптотических клеток, в конце выдерживания промывка не требуется. Окрашенные клетки можно анализировать вживую или фиксировать 4% раствором параформальдегида, например Image-IT™ Paraformaldehyde 4% в 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4, кат. № I28800. Эти фиксированные клетки можно дополнительно обработать для рабочего процесса ICC.

Специфика субстрата
Реагенты для обнаружения каспазы-3/7 CellEvent представляют собой пептид из четырех аминокислот (DEVD), конъюгированный с красителем, связывающим нуклеиновую кислоту. Последовательность пептида DEVD является сайтом расщепления для каспазы-3/7, а конъюгированный краситель не флуоресцентен до тех пор, пока не будет отщеплен от пептида и не связан с ДНК.

Принципы действия
Реагент для обнаружения каспазы-3/7 Green CellEvent по своей природе не флуоресцентен, поскольку пептид DEVD ингибирует способность красителя связываться с ДНК. Однако после активации каспазы-3/7 в апоптотических клетках пептид DEVD расщепляется, что позволяет красителю связываться с ДНК и вызывать яркий флуорогенный ответ.

Простой трехэтапный протокол
Чтобы использовать реагент CellEvent Caspase 3/7 Detection Reagent, просто добавьте его к клеткам, инкубируйте 30–60 минут и визуализируйте. Апоптотические клетки с активированной каспазой-3/7 будут иметь ярко-зеленые или красные ядра, тогда как клетки без активированной каспазы 3/7 будут иметь минимальный флуоресцентный сигнал.

Универсальность анализа позволяет обнаруживать и фиксировать живые клетки
Этот надежный анализ позволяет исследовать активацию каспазы-3/7 в живых клетках. Кроме того, поскольку для обнаружения не требуются этапы промывки, сохраняются хрупкие апоптотические клетки, которые обычно теряются во время этапов промывки. Важно, что флуоресцентный сигнал от реагента для обнаружения каспазы 3/7 CellEvent может выдерживать фиксацию и пермеабилизацию. Это обеспечивает гибкость для выполнения анализов конечных точек и зондирования других интересующих белков с использованием иммуноцитохимии.