Характеристика, идентификация и количественная оценка белка с помощью MS начинается с эффективного, воспроизводимого переваривания белка. Протеазы, специфичные для последовательности, используются для расщепления белков на более мелкие фрагменты или пептиды. Трипсин является протеазой выбора для переваривания белка. Однако раздельное или последовательное переваривание с альтернативными протеазами может улучшить покрытие индивидуальной последовательности белка или создать уникальные последовательности пептидов для различных приложений MS.
• Исключительная селективность — трипсин имеет >95% специфичности к С-концевому лизину и аргинину; LysC имеет >90% специфичности к расщеплению С-концевого лизина
• Высокая чистота — не обнаруживается химотриптическая активность (трипсин)
• Полное переваривание — комбинация ферментов трипсин/LysC снижает пропущенные трипсином расщепления
• Повышенная стабильность — трипсин химически модифицирован для снижения аутолитической активности
• Удобство — ферменты поставляются в стабильных лиофилизированных или жидких форматах

Трипсиновая протеаза — это сериновая протеаза масс-спектрометрического (МС) класса, полученная из экстрактов поджелудочной железы свиньи, которая специфически расщепляет остатки лизина и аргинина на карбоксильной стороне. Фермент обработан TPCK для устранения химотриптической активности и химически модифицирован путем метилирования, что дает высокоактивную и более стабильную форму фермента. Трипсиновая протеаза может переносить обычно используемые частично денатурирующие условия, такие как 0,1% SDS, 1 M мочевина и 10% ацетонитрил. Трипсиновая протеаза наиболее активна при pH от 7 до 9 и может быть обратимо инактивирована при pH < 4. Трипсин можно приобрести лиофилизированным в упаковках по 1 мг по 5 штук по 20 мкг или 100 мкг и в растворе по 100 мкг.

Lys-C-протеаза — это сериновая протеаза масс-спектрометрического (МС) класса, выделенная из Lysobacter enzymogenes. Lys-C-протеаза обладает высокой активностью и специфичностью к остаткам лизина, что приводит к получению более крупных пептидов и меньшей сложности образца, чем трипсин (т. е. меньшему количеству пептидов). В отличие от трипсина, протеаза Lys-C может расщеплять лизины, а затем пролины, что делает ее идеальной для последовательного переваривания белков с последующим трипсином для уменьшения пропущенных расщеплений. Эти уникальные свойства протеазы Lys-C обеспечивают высокую эффективность переваривания при использовании отдельно или с последующим перевариванием трипсином. Кроме того, прототипические пептиды Lys-C обычно имеют более высокие зарядовые состояния, что делает ее ферментом выбора для использования с фрагментацией ETD.

Протеаза Lys-C обычно используется в рабочих процессах обогащения фосфопептидов, поскольку она генерирует пептиды с первичными аминами как на N-, так и на C-конце, что позволяет дважды маркировать фрагменты аминореактивными изобарными метками. Это приводит к усиленной ионизации пептидов и улучшенным пределам количественного определения, поскольку больше ионов фрагментов можно повторно выделить во время получения MS3. Этот фермент можно использовать для рабочих процессов переваривания в растворе или в геле для получения пептидов для идентификации белков методом ЖХ-МС/МС.

Эффективное переваривание белка может быть завершено за два часа при температуре 37 °C. Lys-C Protease остается активной в сильно денатурирующих условиях, таких как 8 M мочевина, 2 M гуанидин-HCl, 1% SDS, 2% CHAPS и 40% ацетонитрил, и хорошо функционирует при pH 7–9 (максимальная активность при pH 8). Этот лиофилизированный фермент имеет массу 30 кДа и стабилен в течение одного года при хранении при –20 °C. Этот фермент Lys-C упакован в лиофилизированном виде (количества 20 мкг или 100 мкг).

Trypsin/Lys-C Protease Mix представляет собой лиофилизированную смесь трипсина и LysC протеаз, которая была оптимизирована для повышения эффективности переваривания белков. Хотя трипсин обычно используется для переваривания белков, одной этой протеазы недостаточно для полного переваривания белков на карбоксильном конце остатков лизина и аргинина. Поэтому протеазу Lys-C обычно комбинируют с трипсином для последовательного переваривания белков с меньшим количеством пропущенных расщеплений. Смесь трипсина/протеазы Lys-C поставляется в гибких форматах 20 мкг, 5 x 20 мкг или 100 мкг. Переваривание может быть завершено всего за 1,5–3 часа или до ночи, в зависимости от соотношения фермента к белку.

Химотрипсин, GluC, Asp-N Протеазы

• Увеличенное покрытие последовательностей — лучшая характеристика белка достигается за счет перекрывающихся пептидов с дополнительными хроматографическими, ионизационными и фрагментационными свойствами
• Высокая удельная активность — каждая протеаза обладает превосходной ферментативной специфичностью
• Стабильность — поставляется в лиофилизированном формате

Asp-N Протеаза — это цинковая металлопротеиназа MS-класса, полученная из мутантного штамма Pseudomonas fragi и требующая следового количества цинка для активности. Asp-N Протеаза расщепляет в основном амино-сторону аспартата и цистеиновой кислоты, которая образуется в результате окисления цистеина. Расщепление может также происходить по глутаминовой кислоте; однако скорость расщепления по остатку глутамина значительно ниже, чем скорость расщепления по остатку аспарагиновой кислоты. Протеаза Asp-N может эффективно переваривать белок в течение 2–20 часов при 37°C с активностью более 20 000 единиц/мг белка и остается активной в денатурирующих условиях, таких как 1 M мочевина, 2 M гуанидин·HCl, 0,1% SDS, 2% CHAPS и 10% ацетонитрил, с оптимальной активностью при pH 6–8. Этот лиофилизированный фермент имеет массу 27 кДа и стабилен в течение одного года при хранении при -20°C.

Протеаза Glu-C, также называемая протеазой V-8, представляет собой сериновую протеазу MS-класса, выделенную из Staphylococcus aureus. Протеаза Glu-C специфически расщепляет карбоксильную сторону остатков глутаминовой кислоты в буферах бикарбоната аммония и ацетата аммония, образуя ограниченное количество пептидных фрагментов. Расщепление может также происходить как по остаткам глутаминовой, так и по остаткам аспарагиновой кислоты в фосфатных буферах. Протеаза Glu-C может эффективно расщеплять белок в течение 5–18 часов при 37 °C с активностью более 500 единиц/мг белка и остается активной в денатурирующих условиях, таких как 2 M мочевина, 1 M гуанидин·HCl, 0,1% SDS, 2% CHAPS и 20% ацетонитрила. Активность Glu-C-протеазы оптимальна при pH 8. Этот лиофилизированный фермент имеет массу 27 кДа и стабилен в течение одного года при хранении при -20 °C.

Химотрипсиновая протеаза — это эндопротеиназа MS-класса, выделенная из поджелудочной железы крупного рогатого скота, которая специфически расщепляет карбоксильную сторону тирозина, фенилаланина, триптофана и лейцина. Две преобладающие формы химотрипсиновой протеазы, A и B, обнаружены в равных количествах в поджелудочной железе крупного рогатого скота. Это похожие белки (80% гомологии), но имеют разные протеолитические характеристики. Обе формы химотрипсиновой протеазы присутствуют в Thermo Scientific Chymotrypsin Protease. Поскольку трипсин может совместно очищаться с химотрипсиновой протеазой, полученной из природных источников, химотрипсиновая протеаза была обработана TLCK для устранения потенциальной триптической активности, улучшая специфичность пищеварения. Химотрипсиновая протеаза может переносить мягкие денатурирующие условия, такие как 0,1% SDS, 2 M мочевины, 2 M гуанидина·HCl, 1% CHAPS и 30% ацетонитрила, с оптимальной активностью при pH 7,5–8,5. Этот лиофилизированный фермент имеет массу 25 кДа и стабилен в течение одного года при хранении при -20°C.